【如何鉴定牛奶中的多种蛋白质中有一种是酪蛋白?】

何建民回答：

　　酪蛋白是牛奶中主要蛋白质,其浓度约为35g/L,是含磷蛋白质的复杂混合物.蛋白质是两性化合物,溶液的酸碱性直接影响蛋白质分子所带的电荷.当调节牛奶的pH值达到酪蛋白的等电点(pl)4.8左右时,蛋白质所带正、负电荷相等,呈电中性,此时酪蛋白的溶解度最小,将会以沉淀的形式从牛奶中析出.而乳糖仍存在于牛奶中,通过离心的方法能将酪蛋白和乳糖分离出.根据酪蛋白不溶于乙醇和乙醚的特性,可用乙醇洗涤以除去粗制品中的脂质,使酪蛋白初步得到纯化.

　　牛奶中含有40％-60%的乳糖,乳糖是一种二糖,它由一分子半乳糖及一分子葡萄糖通过ß-1,4苷键连接.在乳糖分子中,仍保留着葡萄糖部分的半缩醛羟基,所以乳糖是还原性二糖,它的水溶液有变旋光现象,达到平衡时的比旋光度是+53.5.含有一分子结晶水的乳糖的熔点210℃.

　　主要药品与仪器:

　　冰醋酸,乙醇n=0.95,乙醚,牛奶,浓盐酸,pH试纸Ph=3-5,PH=7-9,硅胶G,0.02mol/L醋酸钠溶液,乙酸乙酯,异丙酸,吡啶,苯胺,二苯胺,牛乳糖（纯）,葡萄糖（纯）,活性炭粉,浓硝酸,米伦试剂,硫酸,100g/L氢氧化钠溶液,50g/L氢氧化钠溶液,10g/L硫酸铜溶液,滤纸,尼龙布（200目）.

　　低速冷冻离心机（大容量）,自动指示旋光测定仪,层析缸,抽气吸滤瓶500mL,布氏漏斗,表面皿,烧杯600mL,400mL,100mL,圆底烧瓶,冷凝管,试管10X10mm,薄层层析装置,三角烧瓶500mL,100mL,容量瓶25mL,恒温水浴.

　　操纵步骤:

　　1从牛奶中分离酪蛋白

　　取50mL去脂牛奶置于150mL烧杯内[1].在水浴锅中小心加热至40℃,保持温度,边搅拌边慢慢滴加4mL冰醋酸,此时即有白色的酪蛋白沉淀析出,继续滴加稀醋酸溶液,直至酪蛋白不再析出为止,混合液的PH值为4.8[2].继续搅拌并使悬浊液冷却到室温.放置10min后,将混合物放入离心杯中,于3000r/min离心15min.经滤布过滤上清液于100mL烧杯中,保留做乳糖的分离试验.沉淀（即酪蛋白）转移至另一个烧杯中,加15mL体积分数为=0.95的乙醇,搅匀后于布氏漏斗中抽气过滤,过滤后用滤布代替滤纸.用体积比为1：1的乙醇-乙醚混合液小心洗涤沉淀2次（每次10mL）,最后再用5mL乙醚溶液洗涤1次[3],然后吸滤至干.将干粉铺于表面皿上在室温下挥发去乙醚,烘干,称量并计算牛奶中酪蛋白的含量.

　　取少量酪蛋白溶解于水中,用缩二脲反应,蛋白黄色反应,米伦反应分别定性地观察产生的蛋白质呈现色.

　　2乳糖的分离和鉴定

　　将实验1中离心分去酪蛋白后的上清液（即乳清）置于小蒸发皿中,用蒸气浴小心浓缩至5mL左右,稍冷却后,迅速加入10mL95%乙醇,并用玻璃棒搅拌摩擦,使乳糖析出完全.经布氏漏斗抽气过滤用95%乙醇将乳糖晶体洗涤2次（每次用95%的乙醇将乳糖晶体洗涤2次每次5mL）,即得粗乳糖晶体.

　　将得到的粗乳糖晶体溶于尽可能少的热水中（50-60℃,约8-10mL）.然后再在次热溶液中缓慢滴加乙醇,边加边摇,直至产生混浊为止,再小心水浴中加热使混浊消失,将混合液放置过夜,让其自然冷却,吸滤收集析出的晶体用95%乙醇将乳糖晶体洗涤两次（每次用95%乙醇将乳糖晶体洗涤2次每次5mL）.抽干,产品即含有一分子结晶水的纯乳糖（C12H22O11•H2O）.将精制后的乳糖干燥并测定其比旋度.

　　1．牛奶在实验前不能放置很久,时间过长则其中的乳糖会慢慢变为乳酸影响乳糖分离.

　　2．加入的醋酸不可过量,过量酸会促使牛奶中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖.

　　3．洗涤时注意不要靠近火.

　　4．进行乳糖的变旋光现象操作时应先将测定的仪器和药品准备好,溶液的配置应尽量在2min完成.

　　5．氨水能迅速催化乳糖的变旋光现象,使之达到平衡.